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微生物檢測中常見的生物化學試驗

發布時間:2019-11-04    瀏覽次數:64

一、糖類代謝試驗

1.1 糖(醇)類發酵試驗

不同細菌含有發酵不同糖(醇)的酶,因而發酵糖(醇)的能力各不相同。即使某些能發酵同樣的糖(醇),但其產物也不同,有的產酸產氣,有的產酸不產氣,可根據這些特點來鑒別細菌。
大致可分為:

液體發酵管:無糖肉湯或蛋白胨水中,加入1%糖(醇)類指示劑,一支小玻管,經滅菌后備用。若被檢細菌對營養要求較高時,則在試驗前加入2%~5%無菌血清。

半固體發酵管:在液體糖(醇)發酵培養基中,加入0.3%~0.5%瓊脂,溶化后分裝試管,滅菌后讓試管直立,使瓊脂凝固,做成高層培養基,接種細菌應用接種針穿刺接種。

固體發酵管:此類培養基一般不常用,僅用于營養要求較高的某些細菌,在含糖類及5%~10%血清瓊脂斜面上進行發酵試驗。另外固體高層糖發酵管,可用于厭氧細菌糖發酵試驗,如產氣莢膜桿菌在含糖的固體高層發酵管中出現洶涌發酵(產生大量氣體)。

雙糖(或三糖)高層斜面發酵管:這種培養基含有葡萄糖和乳糖(或再加蔗糖),這兩種糖(或三種糖)混在一起,制成高層斜面,其中葡萄糖和乳糖(或蔗糖)比例為1:10。

各種糖(醇)發酵管含糖(醇)的濃度,一般為0.5%~1%,有時可達2%。經121℃20~30min滅菌,容易水解變質,特別是在堿性溶液中更易破壞。

故糖(醇)發酵培養基常用高壓蒸115℃15min滅菌。

應用的糖(醇)種類很多:
單糖:葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木膠糖、半乳糖;
雙糖:乳糖、麥芽糖、蔗糖、覃糖;
多糖:菊糖、肝糖、糊精、淀粉;
醇:甘露醇、衛矛醇、山梨醇、側金盞花醇、肌醇、丙三醇(甘油);
糖苷:水楊苷等。
最常用的指示劑有酚紅、溴麝香草酚藍、溴甲酚紫、酸性復紅。
前兩者顏色反應較敏感,但穩定性差,后二者比較穩定。特別是一些遲緩發酵的細菌,培養時間長,應用后二者指示劑。
酚紅pH6.8(黃色)~pH8.4(紅色)

1.2 甲基紅試驗(methyl red)

甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4(紅色)~pH6.2(黃色),產氣腸桿菌分解葡萄糖產生丙酮酸,但又很快將丙酮酸脫羧,轉化成醇等物質,則培養液的pH值仍在6.2以上,故此時加入甲基紅指示劑,培養液呈黃色,此為陰性對照菌。陽性對照菌是大腸埃希氏菌,呈現紅色為陽性。

1.3 V-P試驗

伏-普試驗,目的是檢查細菌是否能分解葡萄糖,產生乙酰甲基甲醇。

陽性對照菌是產氣腸桿菌,分解葡萄糖(被檢細菌接種到葡萄糖蛋白胨水中,36℃18~24h)產生丙酮酸,再將丙酮酸脫羧形成乙酰甲基甲醇,在堿性條件下(乙液-40%KOH溶液),被氧化為二乙酰,與培養基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基結合,通常在10min內形成紅色化合物。

若不顯色,放置于50℃水浴2h,或放置于37℃培養箱中4h,充分搖動,觀察培養液反應結果,不顯紅色為陰性,陰性對照菌是大腸埃希氏菌。

1.4 ONPG試驗

鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷的縮寫,利用該試劑可以檢查被檢細菌有無β-半乳糖苷酶和滲透酶,發酵乳糖的細菌具有這兩種酶。

滲透酶將乳糖分子帶入菌細胞內,而β-半乳糖苷酶可將乳糖的β-半乳糖苷鏈切斷,產生葡萄糖和半乳糖。

遲緩發酵乳糖的細菌,缺乏滲透酶,而ONPG滲入菌細胞內,被β-半乳糖苷酶分解產生鄰位硝基苯酚,一般在20~30min內顯黃色,為陽性,對照菌為枸櫞酸鹽桿菌和亞利桑那菌。

方法:將被檢細菌接種到1%的乳糖肉湯瓊脂培養基上,37℃培養過夜。取菌苔接種于0.25ml生理鹽水中做成懸液。加入1滴甲苯,并充分振搖,使酶釋放。在懸液中再加入ONPG液0.25ml,混勻,置于37℃培養箱或水浴箱中,分別在20min和3h后觀察培養液反應結果不出現黃色者為陰性,對照菌是沙門氏菌。

1.5 氧化發酵試驗

測定糖類的氧化或發酵及糖類未被利用的代謝類型。

氧化型:細菌在分解葡萄糖過程中,必須有氧分子參加。無氧環境中不能分解葡萄糖。

發酵型:在分解葡萄糖的過程中,可以進行無氧降解。發酵型細菌無論在有氧或無氧的環境中都能分解葡萄糖。

產堿型:不分解葡萄糖的細菌。
將待檢菌同時穿刺接種兩支HL培養基,其中一支培養基滴加無菌的液體石蠟油,高度不少于1cm,37℃培養48h或更長,觀察反應結果。
培養基變黃色為產酸。

兩支培養基均產酸為發酵型細菌,僅不加石蠟的培養基產酸的是氧化型細菌,兩支培養基均不變化的為產堿型細菌。

二、蛋白質、氨基酸及含氮化物代謝試驗

2.1 苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理:某些細菌具有苯丙氨酸脫氨酶,可使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸,苯丙酮酸與三氯化鐵發生螯合作用,形成綠色絡合物。

方法:將被檢細菌的斜面培養物(先增菌)大量移種到苯丙氨酸瓊脂斜面上,37℃培養18-24h,再從斜面上滴加10%三氯化鐵溶液4-5滴,使其自斜面培養物上緩緩流下,觀察結果。
結果:溶液出現綠色為陽性,對照菌是變形桿菌;不變色為陰性,對照菌是產氣腸桿菌。

2.2 脫羧酶試驗

原理:某些細菌具有某種氨基酸的脫羧酶,可使氨基酸脫去羧基產生胺和二氧化碳,胺使pH值>7,此時指示劑溴麝香草酚藍由綠色變為藍色。
溴麝香草酚藍酸性顯黃色,堿性顯紫色。

方法:將被檢細菌接種到兩支脫羧酶培養基中,其中一支不加氨基酸,另一支加賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸,再在培養基上覆蓋一層滅菌的液體石蠟,37℃培養18-24h,觀察結果。

結果:兩管培養基均含有葡萄糖,產酸,溴麝香草酚藍由藍變黃。含有氨基酸的一管出現脫羧基降解作用,產生堿性反應,溴麝香草酚藍再由黃變藍,為陽性。

鳥氨酸陰性對照菌為陰溝腸桿菌,顯黃色。

2.3 靛基質(吲哚)試驗

原理:某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,產生靛基質(吲哚),靛基質與對二甲氨基苯甲醛結合,形成玫瑰紅色化合物。

方法:將被檢細菌接種到胰蛋白胨水培養基中,37℃培養24-48h后,滴加數滴試劑于培養基液面,輕輕搖動(不可劇烈振動),觀察結果。
結果:出現紅色為陽性,對照菌是大腸埃希氏菌;出現黃色為陰性,對照菌是產氣腸桿菌。

2.4 硫化氫試驗

原理:某些細菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等),產生硫化氫,硫化氫與培養基中的鉛鹽或鐵鹽反應,形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。

方法:將被檢細菌以接種針穿刺接種于醋酸鉛或雙糖鐵培養基(乳糖+葡萄糖)中,37℃培養24h,觀察結果。

結果:有黑色出現為陽性。

說明:在硫化氫試驗的培養基加入硫代硫酸鈉的作用是還原作用,以保持培養基處于還原狀態,是產生的硫化氫不被氧化。

產硫化氫較少的菌種可在試管口放置醋酸鉛試條。

2.5 尿素酶試驗

原理:某些細菌具有尿素酶,在含有尿素的培養基中,分解尿素產生氨,使培養基呈堿性,此時培養基中的酚紅指示劑顯紅色。

方法:將被檢細菌接種的尿素固體斜面培養基上,36℃培養4h檢查一次,再每天檢查一次,培養5天,觀察結果。

結果:出現紅色為陽性,對照菌為變形桿菌;變色為陰性,對照菌是大腸埃希氏菌。

三、枸櫞酸鹽利用試驗

原理:枸櫞酸鹽培養基系一綜合性培養基,其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來源,磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細菌能利用枸櫞酸鈉為碳源,能在培養基上生長,并且能分解枸櫞酸鹽,最后產生碳酸鹽,使培養基變為堿性。培養基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變為深藍色。不能利用枸櫞酸鹽為碳源的細菌在該培養基上不生長,培養基不變色。

方法:將被檢細菌的菌懸液(挑取菌苔后,洗至生理鹽水中)接種到枸櫞酸鹽培養基上,37℃培養24h,觀察結果。

結果:培養基上有菌生長,培養基變為深藍色為陽性,對照菌是產氣腸桿菌;若培養基不變色,則繼續培養7天,培養基仍不變色者為陰性,對照菌為大腸桿菌。

四、呼吸酶類試驗

4.1 氧化酶試驗

原理:某些細菌具有氧化酶,能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化(先使細胞色素C氧化,電子傳遞體)成紅色醌類化合物。

方法:取白色潔凈濾紙蘸取待測菌落,加鹽酸二甲基對苯二胺溶液1滴;Ewing氏改進法,再加α-萘酚溶液1滴。

結果:陽性者立即出現粉紅色,并逐漸加深,變為淡紫色,再到深紫色,Ewing氏改進法陽性于0.5min內呈現鮮藍色,對照菌為綠膿桿菌(銅綠假單細胞菌);陰性者顏色無變化,Ewing氏法陰性為2min內不變色,對照菌為大腸桿菌。

1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液要避免接觸含鐵物質,防止出現假陽性反應。此試劑應少量新鮮配制,于冰箱內避光保存,也可購置氧化酶試條。
該實驗用于分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科(陰性)與弧菌科(陽性)。

4.2 觸酶活力試驗

原理:具有觸酶的細菌能催化過氧化酶,放出生態氧,繼而形成氧分子,出現氣泡。

方法:取3%過氧化氫0.5ml,滴加到不含血液的被檢細菌瓊脂培養物上,或滴加到不含血液的肉湯培養物中,觀察結果。

結果:培養物出現氣泡者為陽性。

說明:過氧化氫濃度過高(30%)會產生氣泡出現假陽性;血液中含有觸酶,容易出現假陽性。

4.3 硝酸鹽還原試驗

原理:某些細菌能將培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽與醋酸作用生成亞硝酸,亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸,再與α-萘胺結合,生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(紅色)。

方法:將被檢細菌接種于硝酸鹽培養基中,37℃培養1~4天,每天吸取培養物2ml,加甲液(對氨基苯磺酸0.8g,5mol/L醋酸100ml)和乙液(α-萘胺0.5g,5mol/L醋酸100ml)各數滴,同時以為接種細菌的培養基作對照,觀察結果。

結果:出現紅色為陽性。

說明:亞硝酸鹽在自然界分布很廣,容易污染試劑,硝酸鹽不純或保管不妥也可能含有亞硝酸鹽,因此必須做空白對照;繁殖迅速而還原硝酸鹽能力強的細菌如果培養時間過久,可能將亞硝酸鹽全部分解為氨和氮,出現假陰性反應,故需每天試驗,空白對照。

五、毒性酶類試驗

5.1 溶血試驗

原理:某些細菌在代謝過程中,產生溶血素,能使人或動物的紅細胞發生溶解。

方法:
1)平板法:將被檢細菌接種到血液瓊脂平板培養基上,37℃培養24h。
2)試管法:取被檢細菌16-18h肉湯培養物若干,加等量經生理鹽水洗滌三次的2%羊紅細胞懸液,置于37℃水浴箱中,30min后觀察結果。

結果:
1)平板法:若菌落周圍出現透明的溶血環,為完全溶血(β溶血),菌落周圍出現綠色溶血環,為不完全溶血(α溶血),無溶血環為不溶血(γ溶血)。
2)試管法:液體澄清透明為溶血,陽性。

5.2 鏈激酶試驗

原理:A群鏈球菌在代謝過程中,產生鏈激酶,能激活血液中的纖維蛋白酶原為溶纖維蛋白酶,促使纖維蛋白凝塊溶解。

方法:取血漿0.2ml,放入滅菌小試管中,加無菌生理鹽水0.8ml,再加被檢細菌18-24h肉湯培養物0.5ml,充分混勻后,再加入0.25%氯化鈣水溶液0.25ml,置于37℃水浴中,觀察結果。

結果:10min內血漿先凝固,而后又開始溶解,溶解時間與鏈激酶含量成正比。鏈激酶含量多時,20min內凝固的血漿完全溶解。如無變化,應在水浴中持續2h、24h,分別觀察結果。血漿凝塊完全溶解者為陽性,時間越短表明毒性越強。24h血凝塊仍不溶解者為陰性。

5.3 血漿凝固酶試驗

原理:某些細菌能產生血漿凝固酶,分兩種,一種結合在細菌細胞壁上,遇到血漿直接作用于血漿的纖維蛋白,使細菌凝成顆粒狀,使用玻片法;另一種分泌到細菌細胞外,稱為游離血漿凝固酶,能使血漿中的纖維蛋白原變為纖維蛋白,使用試管法試驗。

方法:
       1)玻片法:取生理鹽水2滴,分別滴于載玻片上,以接種環挑取被檢細菌菌落,放在2滴生理鹽水中,研磨成濃菌懸液。在1滴懸液中加1滴未稀釋的血漿,另一滴加入1滴生理鹽水作為對照,迅速搖動,觀察結果。

2)試管法:取3支小試管,每支加1:4稀釋的新鮮血漿0.5ml,其中1支加被檢細菌生理鹽水懸液或肉湯培養物0.5ml,另一支加陽性菌株生理鹽水懸液或肉湯培養物0.5ml作陽性對照,再一支加生理鹽水或肉湯培養液0.5ml作陰性對照。3支試管置于37℃水浴箱中,每隔30min觀察一次結果。

結果:
1)玻片法:若在加血漿的1滴中迅速出現凝固顆粒,在加生理鹽水對照的1滴中未出現凝固顆粒,為陽性;若超過2min才開始出現凝固顆粒者不作陽性(多為非致病性)。

2)試管法:6h內,若試驗管和陽性對照管出現凝固,陰性對照管不出現凝固,為陽性;多數陽性細菌在0.5-1h內發生凝固。

六、嗜鹽試驗

原理:在高于3%的氯化鈉培養基上不生長或生長不好,但能在無言培養基上生長的,稱為非嗜鹽菌,如腸桿菌科。能在3%-6%氯化鈉培養基上生長,但在無鹽培養基上不生長,稱為嗜鹽菌,如副溶血性弧菌。在無鹽和高鹽培養基上均能生長,但長得不茂盛,稱為耐鹽菌,如葡萄球菌、銅綠假單細胞菌。

方法:取被檢細菌分別接種到1支無鹽葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化鈉葡萄糖蛋白胨水中,37℃培養6-24h,觀察生長情況。

結果:培養物出現渾濁生長為陽性。

港式五张规则 286659326207923424346619665992989961175925558071881910361670398287824478651835269596391987907160 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();