港式五张规则
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GB4789.3-2016大腸菌群平板計數法細節解讀

發布時間:2019-10-31    瀏覽次數:89

一、無需高壓滅菌的VRBA培養基配制使用問題

1.所用器皿是否需要滅菌?
答:不需要。配制培養基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌,但要求一定要清洗干凈,表面無污漬、無殘留,且晾干無水漬。煮沸完成后,取下錐形瓶,用一般用錫箔紙覆蓋瓶口,用橡皮筋纏繞,待冷卻至適宜溫度即可傾注培養基。在傾注培養基時,須點燃酒精燈,稍微灼燒錐形瓶口。
       2.如何保持培養基“煮沸2min”?
答:培養基加熱煮沸至完全溶解一般采用電陶爐或電熱爐進行,但培養基很難保持煮沸2min,一旦煮沸,則培養基很快上涌、翻騰,若不調低溫度或立刻采取其他措施,則培養基可在數秒內噴涌出來,嚴重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內都是培養基飛濺的范圍(實驗室危險因子之一)。因此,要做到“煮沸2min”,則需在該培養基即將煮沸時調低溫度,待培養基一沸騰就馬上移離熱源,待培養基停止沸騰后,又繼續加熱至沸騰狀態又移開,這樣間歇性煮沸2min。(注意規范操作,做好防燙措施,避免燙傷)

3.若培養基未用完,是否可以冷藏起來下次用?

答:不可以。4789.28中已規定,固體培養基最多允許熔融1次(指的是經過高壓滅菌冷卻后的培養基還可以熔融一次后使用)。且VRBA培養基冷卻后,再次熔融時非常容易噴涌,若溫度控制不當,底部培養基熔融后很快就會發生噴涌。

4.傾注完成后是否需要“覆蓋一層”?如何覆蓋?
答:需要覆蓋。因為培養基冷卻后在表面容易形成一些冷凝水,菌落容易蔓延開,所以在傾注完成后,再覆蓋一層培養基,則菌落不容易接觸到水,這樣不易形成蔓延菌落。在檢驗中最好都進行覆蓋,最好是在原培養基已凝固或半凝固(不會發生晃動)時再傾注一層培養基(“一層”是指緩慢傾注培養基至培養基剛好能夠覆蓋整個平皿)。

二、如何確定培養基上長的是不是大腸菌群?
答:不要去管什么是大腸菌群的典型形態,建議新手們認真按照標準進行證實試驗,此證實試驗非常簡單,每一次VRBA上有菌落生長都進行證實試驗,如此往復3-4次,對于哪種形態才是大腸菌群已經能夠了然于心了。建議平時多配一些BGLB肉湯管冷藏儲存備用,需要進行證實試驗時分分鐘可以完成試驗。

三、兩個梯度都長了菌,如何選取?如何進行證實試驗?菌落選取數量?

答:選取15-150CFU之間的平板(指的是VRBA平板上所有菌落數在此范圍),挑取可疑菌落進行證實試驗。詳細舉例說明:若有兩個連續梯度的4個平板上菌落數均在15-150之間,則4個平板上的菌落都要挑取進行證實試驗,實際操作時,可靈活操作,如:1:10的兩個平板上的菌落數分別為120、123,1:100的兩個平板的菌落數分別為16、18,嚴格來講必須至少在每個平板上分別挑取5個可疑菌落、5個典型菌落進行證實試驗。建議使用鎳合金接種環(即傳統的接種環,而不是一次性塑料接種環),因為VRBA上生長的菌落(無論典型或可疑)大部分長在底層、且菌落一般較大,被培養基覆蓋,傳統的接種環較細,用以刮去上層培養基較方便,挑取菌落也較方便。

確證試驗注意:1).每種可疑菌落挑取5個,每個菌落放入1管GBLB管中;2)“產氣者,記為大腸菌群陽性管”,就要求在實驗前須認真篩選BGLB管,凡小導管中有氣泡的GBLB管應先排去導管中的氣泡再使用。

VRAB平板

VRAB平板上典型大腸菌群菌落形態


BGLB確證陽性結果

四、結果如何計算?

答:首先,在VRBA培養24h后進行計數,分別計數可疑大腸菌群和典型大腸菌群的數量。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:100*6/10*104/g(mL)=6.0*105 CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。

五、若所選適合計數梯度平板上可疑和典型菌落,最終證實全部為陰性,結果如何計算?

答:根據第3條,選取適宜菌落數的平板挑取菌落進行證實試驗,若證實全部為陰性,則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落(建議可疑和典型菌落分別挑取10個)進行證實試驗,若第二次證實試驗均呈陰性,以<1乘以最低稀釋度進行計算,如:1:10的平板菌落數分別為120、123,1:100的平板上菌落數分別為16、18,首先挑取1:100的兩個平板上的菌落進行證實試驗,若全部為陰性,再挑取1:10的兩個平板上的菌落進行證實試驗,若1:10的平板上的菌落數證實為陰性,則最終計算過程為<1x10,最終結果為<10;若1:10的的平板上的菌落有陽性管,則按照第5條進行計算。

港式五张规则 513809226563288228565508267253433761906912145065323978801995986492056921169722700218387438949116 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();